La activación microglial y la protección de la melatonina se han descrito en la retinopatía diabética (RD). Aún se desconoce si la melatonina podría regular la microglía para proteger la barrera hemato-retiniana interna (iBRB). En este estudio, se exploró el papel de la microglía en la ruptura de la iBRB y los mecanismos de regulación de la melatonina sobre la microglía. En las retinas de ratas diabéticas, la microglía activada proliferó y migró de la retina interna a la retina externa, acompañada de cambios morfológicos evidentes. Mientras tanto, se evidenció una fuga significativa de albúmina en el lugar de interacción estrecha entre la microglía activada y los pericitos y células endoteliales dañados. In vitro, las citocinas relacionadas con la inflamación, como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), la interleucina (IL)-1β y la arginasa-1 (Arg-1), aumentaron significativamente en las células BV2 tratadas con CoCl2. El sobrenadante derivado de las células BV2 tratadas con CoCl2 disminuyó significativamente la viabilidad celular y alteró las proteínas de unión tanto en los pericitos como en las células endoteliales, dando lugar a fugas graves. La melatonina suprimió la sobreactivación microglial, es decir, disminuyó el número de células y potenció sus propiedades antiinflamatorias en retinas de ratas diabéticas. Además, se alivió la fuga de iBRB y se restableció la cobertura de pericitos tras el tratamiento con melatonina. In vitro, al tratar con melatonina las células BV2 tratadas con CoCl2, disminuyeron los factores inflamatorios, mientras que aumentaron los factores antiinflamatorios, reduciéndose aún más la pérdida de pericitos y aumentando las uniones estrechas. La melatonina desactivó la microglía mediante la inhibición de las vías de señalización PI3K/Akt/Stat3/NF-κB, manteniendo así la integridad de la iBRB. Los datos actuales apoyan un papel causal de la microglía activada en la ruptura de la iBRB y destacan el potencial terapéutico de la melatonina en el tratamiento de la RD mediante la regulación de la microglía.